作者 ：中國水產科學研究院南海水產研究所/農業部南海漁業資源開發利用重點實驗室　李卓佳　林黑著　楊鏗

淮安大江水產飼料有限公司　唐維可　張善夫

摘要 ：探討芽孢杆菌對質量為30.68（±2.34）g的草魚（腸道消化酶活性 、血清生化指標的影響 。試驗隨機分為5組 ，分別飼喂添加0 、0.5 、1.0 、2.0 、4.0g/kg益生菌（109CFU/g）的飼料養殖4周 ，在14d和28d時取樣 。結果顯示 ，試驗組草魚腸道蛋白酶活性顯著大於對照組 ，各試驗組之間差異不顯著 ；而對澱粉酶 、脂肪酶和纖維素酶活性影響不大 。試驗組草魚血清酚氧化酶（PO） 、酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（AKP）活性顯著大於對照組 ；溶菌（UL）活力在14d時提高不顯著 ，在28d時活力顯著提高 ；試驗組草魚總抗氧化能力（T-AOC） 、過氧化物酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）等抗氧化指標顯著大於對照組 ，除個別組外 ，各試驗組之間差異不顯著 。結果表明芽孢杆菌可以提高草魚機體消化酶活性 、改善理化指標和提高抗氧化能力 ，增強機體免疫機能 。

關鍵詞 ：草魚 ；消化酶 ；血清生化指標 ；芽孢杆菌

草魚是我國主要的經濟養殖魚類之一 ，在水產經濟動物養殖中占有重要地位 ，在提高人民經濟收入方麵發揮著重要作用 。隨著水產養殖業的快速發展 ，草魚養殖生態環境不斷惡化 ，養殖病害日趨嚴重 ，大量抗生素和化學藥品的使用造成致病菌耐藥性日益嚴重 ，嚴重影響了水產品品質 、人類健康及草魚產業化的可持續健康養殖 。因此 ，尋找綠色環保的抗生素替代品就成為研究的重點和熱點 。芽孢杆菌可產生多種消化酶類如蛋白酶 、脂肪酶 、澱粉酶和多種抑菌物質 ，具有無毒 、無殘留等優點 ，被認為是安全有效的有益微生物 。而且 ，芽孢杆菌在儲存過程中以孢子體形式存在，能夠耐受水產顆粒飼料生產的加工工藝 ，熱穩定性良好 。有研究表明 ，在日糧中添加益生菌既能提高魚類和蝦的消化酶活性 ，促進生長 ；又能提高異育銀鯽和東方魚魨的非特異性免疫功能 ，增強抗病力 。目前 ，芽孢杆菌在草魚養殖中的應用多體現在其對草魚養殖環境生態因子的影響上 ，對草魚消化酶活性及生化指標的影響尚未見報道 。因此 ，本試驗旨在研究芽孢杆菌對草魚消化酶活性及血清生化指標的影響 ，為益生芽孢杆菌在草魚健康養殖中的推廣應用提供科學依據 。

1材料與方法

1.1試驗材料

草魚購自番禺立海養殖場 ，經過7d的室內過渡馴化暫養後挑選體重30.68（±2.34）g的健康魚苗進行試驗 。試驗用飼料為豆粕-魚粉型 ，製成5組顆粒飼料（粒徑1.0mm） ，芽孢杆菌（109CFU/g）添加量分別為0 、0.5 、1.0 、2.0 、4.0g/kg飼料 。芽孢杆菌由中國水產科學研究院南海水產研究所提供 。

1.2試驗方法

1.2.1試驗設計與管理

試驗魚隨機分為5組 ，每組3個重複 ，每個重複30尾魚 ，置於80cm×80cm×70cm水池中養殖4周（2011年4月18日到5月15日） ，水溫 、pH值 、溶氧 、NO2-等指標每天監測1次 。投料量按照魚體重的1%於每天8 ：00 、17 ：00各飼喂1次 ，水溫27.0（±2.0）℃ ，pH值7.3~7.9 ，溶氧7.6~8.2mg/L ，NO2-0.01~0.02mg/L 。

1.2.2腸胃粗酶液製備試驗

第14d 、第28d分別每組隨機取樣6尾魚（2×3重複） ，按於書坤等（1986年）的方法將所取樣本的胃和腸道剝離後用ddH2O衝洗 ，用濾紙吸幹後迅速稱重 ，搗碎後移入勻漿器內勻漿定容至100mL ，在-4℃下離心20min（5000r/min） ，取上清液備用 。

1.2.3消化酶活性測定蛋白酶 、脂肪酶和纖維素酶測定

參照中山大學（1979年）的方法進行 。腸蛋白酶活性測定緩衝液pH值為7.2 ，胃蛋白酶活性測定緩衝液pH值為3.0 ；在溫度37（±1）℃下 ，每分鍾水解酪蛋白（5mg/mL）產生1μg酪氨酸為1個酶活性單位 。脂肪酶測定的緩衝液pH值為7.5 ，在溫度37（±1）℃下 ，每分鍾產生1μmol脂肪酸為1個酶活性單位 。纖維素酶活性測定緩衝液pH值為4.8 ，在溫度40（±1）℃下 ，每分鍾催化纖維素生成1μg葡萄糖為1個酶活性單位 。澱粉酶測定參照上海醫學化驗所（1979年）的方法進行 ，緩衝液pH值為6.8 ，在溫度37（±1）℃下 ，100mL酶液在30min內完全水解10mg澱粉為1個酶活性單位 。

1.2.4血清的收集試驗

第14d 、第28d每組隨機取6尾草魚（2×3重複） ，麻醉後尾靜脈取血 ，血樣靜置於4℃冰箱內2h ，血液凝固後離心（3500r/min ，30min）即可收集上清液血清 ，-20℃保存備用 。

1.2.5血清生化指標檢測

（1）溶菌（UL）活力 。以溶菌微球菌凍幹粉（南京建成生物工程研究所生產）為底物 ，參考王雷等（1995年）方法 。置96孔板於冰台上 ，加入底物懸液（OD570為0.35～0.45 ，300μL/孔） ，再加入5μL血清混勻 ，於多通道分光-熒光光度計TECANSAFIRE中 ，設定溫度為37(±0.5)℃ ，在波長570nm下 ，每2min測量1次 ，測定各反應體係的吸光值A ，共測量15次 。溶菌活力UL=(A終值-A初值)/A終值 。

（2）酚氧化酶（PO）活力 。以L-多巴為底物 ，采用改進的Ashida方法（1971年）在96孔酶標板中進行 。把10μL血清加入96孔酶標板中 ，再向各孔中加入200μL磷酸鹽緩衝液（0.1mol/L ，pH值6.0） ，最後向各樣品孔中加入10μLL-多巴液（0.01mol/L） ，在酶標儀（550，Bio-Rad）中振蕩3次 。在波長490nm下 ，每4min測定其吸光值 。酶活力定義 ：在試驗條件下 ，OD490每分鍾增加0.001為1個酶活力單位 。

（3）磷酸酶活力 。堿性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）活性測定均采用磷酸苯二鈉法 。AKP以1mL血清在溫度37（±0.5）℃下 ，與底物作用15min ，產生1mg酚為1個酶活力單位 ；ACP以1mL血清在溫度37（±0.5℃）下 ，與底物作用60min ，產生1mg酚為1個酶活力單位 。

（4）抗氧化指標 。總抗氧化能力（T-AOC） 、超氧化物酶（SOD） 、過氧化氫酶（CAT）活性等用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒檢測 。T-AOC定義為 ：在溫度37（±1）℃下 ，每1mL血清每分鍾吸光度增加0.001為1個酶活性單位 ；SOD活力定義為 ：每毫升反應液中SOD抑製率達50%時所對應SOD的量為1個酶活力單位 ；CAT酶活性單位定義為 ：1mL血清每秒鍾分解1μmolH2O2的量為1個酶活力單位 。酶液蛋白濃度測定 ：以標準牛血清白蛋白作為標準 ，采用考馬斯亮藍G-250染色法 。

1.2.6數據處理

試驗數據以平均值±標準差表示 ，采用軟件SPSS11.0進行單因子方差分析 ，Duncan’s多重比較 ，以P<0.05作為差異顯著性標準 。

2結果與分析

2.1芽孢杆菌對草魚消化酶活性的影響

第14d時的檢測結果（圖1）顯示 ，胃蛋白酶和腸蛋白酶在芽孢杆菌添加量為1.0g/kg時獲得最大活性 ，澱粉酶 、脂肪酶在2.0g/kg時獲得最大活性 。試驗組蛋白酶活性顯著大於對照組 ，澱粉酶 、脂肪酶和纖維素酶活性與對照組之間差異不顯著 ，各試驗組之間差異也不明顯 。第28d時的檢測結果（圖2）顯示 ，試驗組胃蛋白酶和腸蛋白酶分別在芽孢杆菌添加量為1.0、0.5g/kg時獲得最大活性 ，顯著大於對照組 ，各試驗組之間差異不顯著 。

澱粉酶和脂肪酶均在芽孢杆菌添加量為1.0g/kg時獲得最大活性 ，試驗組和對照組之間差異不顯著 。除胃蛋白酶外 ，第28d時檢測的腸蛋白酶 、澱粉酶和脂肪酶獲得最大活性時的芽孢杆菌添加量比第14d時的添加量小 ，對纖維素酶活影響不大 。28d時各消化酶活性與14d時各消化酶活性之間差異不顯著 。

2.2芽孢杆菌對草魚血清生化指標的影響

第14d時的檢測結果（圖3）表明 ，PO 、AKP 、UL分別在2.0 、1.0 、1.0g/kg芽孢杆菌組活力最大 ，試驗組顯著大於對照組（UL除外） ，各試驗組之間的差異不顯著 。ACP以2.0g/kg組活力最大 ，略大於1.0 、4.0g/kg組 ，顯著大於0.5g/kg組和對照組 。

第28d時的檢測結果（圖4）和第14d時的檢測結果表現出相似的規律性 。PO 、AKP 、UL分別在2.0 、1.0 、1.0g/kg組獲得最大活力 ，試驗組顯著大於對照組 ，各試驗組之間差異不顯著 。ACP以2.0g/kg組活力最大 ，略大於1.0g/kg組 ，顯著大於0.5 、4.0g/kg組和對照組 ，0.5、4.0g/kg組和對照組之間也表現出顯著差異水平 。28d時各理化指標與14d時差異不顯著 。

2.3芽孢杆菌對草魚血清抗氧化能力的影響

第14d時的檢測結果（表1）顯示 ：試驗組T-AOC顯著大於對照組 ，但各試驗組之間差異不顯著；試驗組CAT和SOD活性均顯著大於對照組 ，除0.5g/kg組外 ，各試驗組之間差異不顯著 。第28d時檢測結果顯示 ：0.5 、4.0g/kg組T-AOC和SOD活性和對照組之間差異顯著 ，1.0 、2.0g/kg組和對照組之間差異極顯著 ，各試驗組之間差異不顯著（0.5g/kg組除外） ；2.0 、4.0g/kg組CAT活性和對照組之間差異顯著 ，0.5 、1.0g/kg組和對照組之間差異極顯著 。在不同的芽孢杆菌含量條件下 ，隨著時間增加各抗氧化指標有增加趨勢 ；除個別指標外 ，28d時各抗氧化指標較14d時大 。

生化指標

圖4第28d芽孢杆菌對草魚生化指標的影響

注 ：表中同列數據後小寫英文字母不同者表示差異顯著 ，大寫英文字母不同者表示差異極顯著 。

3討論

3.1芽孢杆菌與腸道消化酶活性

消化酶作為維持機體正常代謝的重要生命活性物質之一，催化調節生物體內各種化學變化 ，促進機體對飼料的消化 ，提高飼料利用率 。有研究表明 ，芽孢杆菌可提高對蝦消化酶活性 ，添加量為1.0g/kg飼料時 ，對蝦增重率提高8.2% 、蛋白質效率提高13.2% 、飼料係數降低9.7% ，促進了對蝦的生長 。本課題組前期研究芽孢杆菌對南美白對蝦生長性能及消化酶活性的影響時也得到相似的結果 。本試驗中 ，芽孢杆菌可提高草魚消化酶活性，表明芽孢杆菌的應用有利於機體對養分的消化吸收 ，這與芽孢杆菌可以提高異育銀鯽和三角帆蚌消化酶活性的研究結果一致 ，與酶製劑對鯉魚腸道消化酶活性的影響有所不同（葉元土等 ，1993年） 。這可能是由於芽孢杆菌對消化酶活性的影響與酶製劑的影響作用機製不同有關 ，兩者不同的作用機製有待於進一步探討 。芽孢杆菌對消化酶活性的影響可能與芽孢杆菌能產生蛋白酶 、澱粉酶等酶類和酶促因子有關 ，也與芽孢杆菌代謝產生氨基酸 、多肽 、維生素 、微量元素等多種活性物質有關 。因為這些活性物質既能補充機體營養又具有代謝活性 ，參與調節養分在機體內的代謝過程 ，改善機體生理活動 ，從而提高宿主消化酶活性 。消化酶活性反過來促進機體對養分的消化吸收 ，改善機體的消化功能 。這也成為芽孢杆菌促進機體生長和提高生產性能的重要構成因素 。

3.2芽孢杆菌與血清生化指標

魚蝦等低等水生養殖動物在抵抗外來入侵病原菌或條件致病菌的過程中 ，其非特異性免疫機在清除異物發揮著重要作用 。Sritunyalucksana等研究報道 ，PO具有免疫調節活性 ，凡納濱對蝦SOD也具有免疫調節活性 ，可以用來衡量機體免疫力高低 。也有研究表明 ，芽孢杆菌添加量為1.25×104CFU/mL時 ，南美白對蝦的PO 、SOD 、UL等免疫指標分別比對照組提高3.0 、2.6和1.1倍 。反映非特異免疫機能的生化指標UL 、PO 、ACP 、AKP等參與構成魚類抵抗病原的第一道屏障 。非活化態的PO原激活係統可以識別外來物並啟動或增強與機體抗病有關的反應 ，激活後（如芽孢杆菌代謝產生的活性成分）生成PO可以催化酚轉化為黑色素 ，抑殺某些病原菌 。Chen等報道 ，虹鱒魚的非特異免疫水平UL在受到外源微生物侵染時增加 ，並在10周後表現最大活性 。ACP 、AKP均是吞噬溶酶體的重要組成部分 ，在血細胞進行吞噬和包囊反應中 ，會伴隨有ACP的釋放 。本試驗中試驗組草魚的血清生化指標得到改善 ，這與Harikrishnan等研究芽孢杆菌對牙鮃免疫機能影響及地衣芽孢杆菌對三角帆蚌免疫機能的影響時所報道的結果相似 。表明芽孢杆菌對草魚體液免疫因子產生明顯影響 ，有利於增強草魚抗病力 。

3.3芽孢杆菌與抗氧化能力

研究表明 ，T-AOC是用來衡量機體抗氧化係統機能狀況的綜合性指標 ，反映機體對外來刺激的代償能力以及機體自由基代謝的狀態 。Ko等研究報道 ，飼喂1.5%亞油酸對試驗動物SOD和CAT活性產生影響 ，尤其對CAT影響明顯 ，能清除多餘的活性氧和過氧化物 ，減少自由基對正常細胞的損傷 ，提高機體抗氧化機能和抗病力 。高等動物體內SOD存在CuZn-SOD和Mn-SOD兩種 ，可以清除生物體內超氧陰離子自由基(O2-)，調節機體內的氧化與抗氧化過程 ，保護細胞免受損傷 。在乳酸菌作用下 ，SOD和穀胱甘肽活性增強 ，表現出清除機體羥自由基、過氧化氫以及抗脂質過氧化的活性 。本試驗中 ，芽孢杆菌對試驗組草魚抗氧化指標的影響作用與地衣芽孢杆菌應用於三角帆蚌養殖 ，可以提高三角帆蚌的抗氧化能力相似 。表明草魚養殖中應用芽孢杆菌可以提高草魚的抗氧化效果 ，但其作用機製還需要進一步研究探討 。